El carácter antimicrobiano de los aceites esenciales: primeros resultados

Ya tenemos los resultados de los experimentos preliminares que hemos hecho para comprobar si el diseño experimental era el adecuado. Hemos ensayado los extractos completos obtenidos de las diversas plantas así como de de los aislados que habíamos obtenidos. 

Recordemos el procedimiento, aunque lo tenemos descrito en entradas anteriores. Sobre placas de Petri con medio TSA extendemos 5 ml de medio semisólido que habíamos inoculado con 100 microlitros de cultivos bien de extractos completos o de algunos aislados. Una vez solidificada esta capa se dispusieron sobre ella 6 discos de papel de filtro; a cada uno de ellos se le añadió 5 microlitros de cada uno de estos aceites esenciales: ajedrea, lavanda, romero, salvia y tomillo. El sexto no se impregnó de modo que actuase como control para desechar que los discos tuviesen algún tipo de efecto inhibidor del crecimiento.

La figura de arriba muestra el efecto de los aceites esenciales citados sobre el extracto completo de esparto y sobre dos colonias aisladas a partir de este. En el extracto completo aparecen discos de inhibición alrededor de los discos con aceites esenciales de ajedrea y tomillo. Los dos aislados muestran actividad importante frente a estos dos aceites y además, con menor intensidad en la lavanda y la salvia. El aceite de romero no parece tener efecto sobre estos microorganismos.

En el caso del matagallos, la imagen de la izquierda muestra el efecto del extracto completo, donde se aprecian discos alrededor de la ajedrea, tomillo, salvia y lavanda. En el aislado MAT 2 se aprecian discos en torno a los discos con aceites de ajedrea, tomillo y lavanda.

En la imagen de arriba se compara el efecto de los aceites sobre los extractos completos de romero, de plantas procedentes de Órgiva (recolectadas por María Ángeles) y de romero de nuestro huerto. En este último caso, podemos apreciar dos tipos de colonias que crecen alrededor de los discos con aceite de ajedrea y tomillo, una más sensible que otra.

La imagen de arriba muestra la sensibilidad de las bacterias de los extractos de tomillo de Órgiva a los distintos aceites esenciales. Hemos ensayado también algunos de los aislados individuales de este extracto, aunque no nos han crecido hasta ahora. Las hemos dejado incubando fuera de la estufa, a la vuelta de vacaciones veremos si hay resultados.

La imagen de arriba muestra el carácter inhibidor de los aceites esenciales sobre el extracto completo de lavanda de nuestro huerto y de dos aislados, el LAV1 y el LAV 2. Como muestran las imágenes hay gran diferencia entre la sensibilidad en estos dos aislados.

Tenemos también resultados de la salvia de nuestro huerto, tanto del extracto completo como del aislado SAL 2. Igualmente son sensibles a los aceites de ajedrea y tomillo. En este caso me quedan mis dudas de que hayamos intercambiado los rótulos de las placas, o lo que es igual, que hayamos cambiado las bacterias con las que hemos inoculado las placas.

 

De las hojas de haba y de hiedra recolectadas en nuestro instituto aislamos de cada una de ellas un microorganismo que daba lugar a crecimientos muy similares y que resultaban muy invasivo extendiéndose con mucha facilidad por las placas. Como se puede apreciar, son muy sensibles a algunos de los aceites esenciales.

La imagen de arriba muestra la sensibilidad de un aislado de extractos de hoja de laurel a los aceites que ensayamos. Podemos ver el efecto inhibidor del crecimiento de las bacterias LAU 1 del tomillo y de la ajedrea principalmente, y con pequeña intensidad del aceite de lavanda.

 Por último, y por ahora, mostramos el efecto inhibidos de los aceites sobre un microorganismo aislado de las hojas del naranjo (NAR 1). En este caso también hay un efecto muy importante del tomillo, la ajedrea, y en menor cantidad de aceite de lavanda y de salvia.

A la vuelta de vacaciones repetiremos estos experimentos con placas que está preparando María Ángeles. Las traerá preparadas para que únicamente añadamos los aceites esenciales y las incubemos. Pero mientras tanto podemos ir haciendo un análisis de nuestros resultados e intentar responder a preguntas como cuál pensáis vosotros que es el aceite esencial con mayor potencial antimicrobiano, cómo los ordenaríais de mayor a menor actividad, o si veis diferencias entre la sensibilidad de los extractos completos y los de aislados específicos.

Los resultados nos están acompañando un proyecto que está resultando maravilloso. Pero lo que lo hace verdaderamente bonito es vuestra participación. En el párrafo anterior os he hecho algunas sugerencias, pero lo importante es que analicéis nuestros resultados y comentéis lo que os sugieran. Y lo más importante, esto es un proyecto de todos y entre todos debemos compartir nuestras ideas en los comentarios.

Ensayamos el carácter antibacteriano de los aceites esenciales

En entradas anteriores veíamos cómo aislábamos los microorganismos que habían sido extraídos de las plantas. Hoy hemos comenzado los experimentos para comprobar el carácter antimicrobiano de algunos aceites esenciales. Para ello vamos a hacer una técnica un poco laboriosa que consiste en sembrar los microorganismos de modo que crezcan de una manera uniforme, en césped, por toda la superficie de la placa de Petri a la vez que los ponemos en contacto con los aceites esenciales.

Partiremos de cultivos líquidos en los que habrán crecido las bacterias cuya sensibilidad vamos a estudiar. Para ello habríamos tomado de las colonias aisladas en días anteriores una poca muestra de microorganismos con el asa de siembre y las habríamos depositados en los tubos con medio líquido TSB (caldo de soja y tripticaseína), dejando que creciesen. Presumimos que a las 48 habrían alcanzado la fase estacionaria.

Tendremos placas de Petri con el medio de cultivo que habitualmente utilizamos, TSA (agar de soja y tripticaseína), aproximadamente hay unos 20 ml cada placa. Tendremos también preparados tubos de ensayo estériles con 5 ml de agar semisólido; estos los preparamos a partir del medio liquido TSB añadiendo agar-agar al 0,6%; mantendremos el medio líquido poniendo los tubos en un baño a 42ºC, temperatura suficiente para que el medio esté liquido, pero no tan elevada como para matar a los microorganismos. Inocularemos estos tubos con 100 microlitros del medio líquido con las bacterias a ensayar e inmediatamente dejaremos caer el contenido sobre las placas con medio sólido.

Una vez solidificado, colocaremos sobre la superficie, y regularmente espaciados, seis discos de papel de filtro grueso, a los cuáles añadiremos 5 microlitros de cada uno de los aceites esenciales siguientes: romero, tomillo, salvia, lavanda y ajedrea (este último por presentar una elevada capacidad de inhibir el crecimiento de microorganismos, tal y como se demostró en un proyecto previo). Vamos a dejar un disco sin impregnar, de modo que nos sirva como control sin aceite esencial. Una vez realizado este proceso los dejaremos incubar durante 48 horas en una estufa a una temperatura de 28ºC. Los microorganismos deberán crecer por toda la superficie de la placa y en el caso de que las bacterias sean sensibles al aceite esencial apreciaremos un círculo carente de bacterias en torno al disco de papel.

Aislamos microorganismos de nuestras plantas

Hoy hemos tenido sesión con los dos grupos de primero de ESO. La tarea que teníamos para hoy era la de aislar de las placas donde habíamos sembrado los extractos de las hojas las bacterias que usaremos en los experimentos siguientes de inhibición. Hemos seleccionado tres colonias de cada muestra de planta.

Para ello, previamente hemos analizado las placas y hemos localizado colonias que estuviesen claramente aisladas del resto, de forma que pudiéramos tomar microorganismos únicamente de ellas. Las hemos etiquetado para saber en todo momento cuál era la colonia elegida y después, con la punta de un palillo de dientes estéril hemos tocado la colonia y hemos tocado sobre una placa estéril, en la que hemos marcado con puntos las posiciones de siembra y rotulado con el nombre de la colonia.

Hemos aprendido también a sembrar placas de Petri en estría con asa de siembra. Aquí el procedimiento ha sido un poco más complejo. Tras seleccionar las colonias, hemos calentado el asa hasta ponerla al rojo (así nos aseguramos la esterilidad de la misma), hemos esperado que se enfríe y hemos tocado sobre la colonia. Seguidamente hemos ido deslizando suavemente el asa por la superficie del medio del cultivo, evitando dañarlo. Finalmenteh hemos vuelto a esterilizar nuestra asa.

Todas las muestras las hemos dejado incubando a 26ºC en nuestra estufa. Esperemos resultados para ver si hemos conseguido aislar correctamente los microorganismos.

Y puesto que con la clase de primero A nos ha quedado algo de tiempo, algunos de los jóvenes han aprendido a utilizar el microscopio digital Dinolyte.

Los experimentos con las plantas control de nuestro huerto. Resultados

El pasado miércoles, con el grupo de primero de ESO B, hicimos la extracción de microorganismos de las hojas de las plantas de nuestro huerto. Las plantas que hemos elegido son la haba (Vicia faba), el laurel (Laurus nobilis), la hiedra (Hedera helix), el naranjo (Citrus sinensis) y el rosal (Rosa sp.).

Obtuvimos las suspensiones de microorganismos poniendo en un tubo Falcon 3 gramos de hojas finamente cortadas en 20 mililitros de solución de arrastre. Aprendimos de la sesión anterior que algunas hojas son tan livianas que en algunos casos tuvimos problemas para hacer preparar las suspensiones. De esta manera teníamos menor volumen pero la misma proporción hojas/solución de arrastre.

A continuación os dejo las imágenes de las placas, tras dos días de incubación en nuestra estufa a 26ºC. 

En una primera apreciación vemos que las placas, para cada planta presentan un aspecto muy similar, con un número más o menos parecido de colonias y con los mismos tipos. Aunque hay una excepción, y es en una de las placas del rosal; en este caso se aprecia un crecimiento mucho mayor con múltiples colonias y mucho más pequeñas que en las dos primeras. Si recordáis, el aspecto es parecido a algunas de las placas que preparasteis en vuestras casas. Todo apunta a que se nos ha contaminado (hemos podido tocar la punta de la micropipeta o que esta toque algo, dejar la placa demasiado tiempo destapada...). Cuando esto nos sucede, placas como estas las tenemos que desechar.

Pero ahora es el momento de que hagáis vuestra valoraciones. Es necesario que comentéis cómo véis las placas, qué diversidad de colonias véis tanto en color como en forma o tamaño, qué número véis... Cualquier cosa que os parezca interesante. Y anotarlo tanto en vuestro cuaderno de laboratorio como en el blog. Esta mañana hemos comentado en clase que funcionamos como un equipo de investigación y tiene que haber un lugar en el que podamos ver todas las interpretaciones y valoraciones de nuestros resultados para que después lleguemos a las mejores conclusiones.

El siguiente paso de nuestro proyecto va a ser aislar algunas de las bacterias de estos cultivos a partir de las colonias que veamos más separadas del resto, y con ellas empezar nuestros experimentos para comprobar cómo afectan los aceites esenciales al desarrollo de los microorganismos.

Y ahora os dejo unas fotos de la sesión del otro día, en las que se os ve realizando las distintas tareas de estos experimentos.

Las plantas, las otras protagonistas de nuestro proyecto. Imágenes interesantes.

Parece que en nuestro proyecto nos estamos centrando bastante en los microorganismos, en las bacterias. Nos referimos a las placas, a los cultivos, a las colonias... Y parece que dejamos en un segundo plano a las plantas. Pues bien, como nuestro proyecto no deja de sorprendernos, os dejo aquí algunas imágenes hechas a grandes aumentos de las hojas de nuestras plantas.

Como ya sabéis, los que habitualmente pasáis por el laboratorio tenemos un lupa binocular a la que le conectamos una cámara digital mediante la cual podemos tomar imágenes con un ordenador. Pues a esto se le suma que nos han prestado un microscopio digital Dinolite, muy cómo de usar y que como veréis también nos permite hacer cosas interesantes. 

Puesto que solo tenemos uno de cada, los que queráis aprender a usarlos y a obtener fotos tan interesantes os podéis pasar durante los recreos por el laboratorio y observar y hacer algunas fotos de nuestras plantas. En cuanto estén en flor, las imágenes van a ser maravillosas.

Por ahora nos vamos a conformar con las hojas. A todos vosotros os llamó la atención el aspecto de las hojas del matagallos. Pues bien, ahora vais a saber por qué ese aspecto. Se trata de que están cubiertas de unos pelitos estrellados. Y también he observado las hojas de tomillo.

Pero lo importante serán vuestras observaciones. Os espero en el laboratorio para hacer nuevas fotos.

Hoja de matagallos. Observación bajo la lupa binocular a 20X.

Hoja de matagallos. Observación con el microscopio digital Dinolite.

Hoja de tomillo bajo la lupa binocular (20X).

Hoja de tomillo bajo la lupa binocular (20X)

 

Hojas de tomillo fotografiadas con el microscopio digital Dinolite.

Primeros resultados con plantas aromáticas

Ya tenemos resultados de los experimentos que realizamos el lunes con las plantas que nos trajo María Ángeles y con algunas procedentes del huerto de nuestro instituto. Como ya comentamos, preparamos nuestras suspensiones de tomillo, romero, matalobos y esparto. Y de las nuestras, suspensiones de salvia, lavanda y romero.

Incubamos en la estufa a 26ºC durante dos días y hemos dejado otro más a temperatura ambiente. Esta mañana hemos hecho las fotos de las placas que incluimos a continuación.

 

Llegados a este punto es importante que veamos la cantidad de colonias que aparecen, la morfología de las mismas (tamaño, color, forma...) y en función de todo esto la variedad, el número de colonias distintas en cada placa. También identificaremos si hay micelios (crecimiento de hongos) en ellas.

El número de bacterias que puede aparece en cada placa puede no ser muy ilustrativo si no consideramos las condiciones, cantidad de hojas, y los volúmenes que hemos añadido. Aunque la idea inicial era de poner 6 gramos de hojas de plantas en 40 ml de solución de arrastre, en algunas plantas esto no fue posible por el volumen que ocupaban las hojas. Repasamos aquí cómo preparamos cada muestra.

Muestras procedentes del campo:

Romero: 6 gramos de hojas/40 mililitros de solución de arrastre. (0,15 g/ml)

Tomillo: 6 gramos de hojas/40 mililitros de solución de arrastre.(0,15 g/ml)

Esparto: 3 gramos de hojas/40 ml de solución de arrastre. (0,075 g/ml)

Matagallos: 4 gramos de hojas/40 ml de solución de arrastre. (0,10 g/ml)

Las suspensiones de las plantas del huerto se prepararon con 1 gramo de hojas/10 mililitros de solución de arrastre (0,10 g/ml). 

Ahora es momento de estudiar las placas a partir de los imágenes de arriba. Las muestras de los tomillos parecen bastante interesantes, pues permiten comparar tanto la cantidad como la variedad de colonias en la misma planta en su estudio natural como en las condiciones del huerto. Esperamos vuestros comentarios.

Iniciamos los experimentos para aislar microorganismos de las plantas

Hoy hemos tenido nueva sesión del proyecto, en esta caso con el alumnado de primero de ESO A. María Ángeles, nuestra investigadora, recolectó ayer una serie de plantas aromáticas y esta mañana hemos iniciado los experimentos para aislar microorganismos de las mismas. Estas plantas son el tomillo aceitunero (Th,ymbra capitata), el romero (Rosmarinus officinalis) y el matagallos (Phlomis purpurea) que pertenecen a la familia de las labiadas (Labiatae), y el esparto, una gramínea (Stipa tenacissima) . 

Tras una explicación inicial por parte de María Ángeles hemos pasado a los experimentos en sí. Hemos pesado 10 gramos de hojas de esas plantas y los hemos mezclado en unos tubos llamados Falcon con 40 mililitros de una solución de arrastre que lleva una pequeña cantidad de un detergente; este no debe afectar a la supervivencia de las bacterias pero facilitará su separación de las zonas hidrofóbicas de las hojas; las plantas aromáticas, como las que estudiamos, tienen sustancias lipídicas -insolubles en agua- en las hojas a las que se pueden quedar adheridos los microorganismos. Hemos agitado suavemente, hemos dejado reposar unos minutos y con ayuda de una pipeta automática hemos depositado 100 microlitros (0,1 mililitro) en una placa de Petri con medio de cultivo TSA estéril. A continuación hemos extendido la gota por toda la placa con un asa de Vinogradsky. Finalmente hemos puesto las placas a incubar. En una próxima sesión repetiremos el procedimiento con las plantas de nuestro huerto que no pertenecen a la familia de las labiadas, las plantas aromáticas.

Mientras esperamos los resultados dejamos unas fotos de la sesión que ilustran los procedimientos que hemos llevado a cabo. De todo lo que hemos hecho debe quedar constancia en nuestro cuaderno de laboratorio, y tampoco estaría nada mal que dejáramos algunas notas en los comentarios. Nos resultarán muy útiles cuando tengamos que preparar nuestras exposiciones en la presentación de los proyectos en la Estación Experimental del Zaidín.

La recolección de plantas en la Alpujarra

Este domingo nuestra investigadora, María Ángeles, ha estado recolectando las plantas mediterráneas que vamos a ensayar en nuestro proyecto. Lo ha hecho cerca una pedanía de Órgiva llamada Los Tablones, en la Alpujarra. En esta primer imagen podemos ver el aspecto de la zona, con el matorral típico, donde aparecen plantas como el tomillo, el romero o el matagallo. Un entorno más natural para nuestras plantas es imposible.

En esta otra foto aparece una aulaga, una planta muy espinosa que pertenece a la familia de las papilionáceas, y que tendrá más adelante flores amarillas.

Y para acabar esta entrada, incluimos un par de fotos de nuestra investigadora en plena tarea de recolección de muestras.